۳-۵-۳. غلظت بهینه پروب:

جهت یافتن غلظت بهینه پروب واکنش Real-Time PCR با بهترین غلظت پرایمر و سه غلظت ۲/۰، ۳/۰ و ۴/۰ میکرومولار پروب در حجم کلی ۱۵میکرو لیتر انجام شد. انتخاب غلظت مناسب بر اساس چرخه آستانه کمتر و میزان فلورسانت بیشتر تعیین می شود.

۳-۵-۴. تهیه سریال رقت به منظور بررسی کارائی[۱۴] پرایمرها :

از انجایی که نزدیک بودن کارایی پرایمرها در جواب نهایی بسیار مهم است می بایست کارایی پرایمر های مورد استفاده سنجیده شود که این امر بصورت ذیل انجام گردید:
ابتدا از cDNA مربوط به چندین نمونه Testis موجود یک Gene Pool بدست آمد. سپس با بهره گرفتن از OD نمونه نهایی ۵ رقت ۴/۱ساخته شد. لازم بذکر است که بررسی کارایی پرایمر برای هر کدام از ژن های مورد مطالعه در این تحقیق انجام شد. تمام واکنش ها در این مرحله بصورت Duplicate انجام شد. منحنی استاندارد[۱۵] رسم شده توسط خود دستگاه شامل اطلاعاتی در مورد کارائی، شیب نمودار و رگرسیونR2 می باشد. کارایی کمتر از ۹۰% می بایست از نظر اندازه آمپلیکون، ساختارهای ثانوی و طراحی پرایمر دوباره چک شده و بهینه سازی شود.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۶-. انجام تکنیک Real-Time PCR بر روی نمونه های مورد مطالعه :

واکنش Q-RT-PCR با بهره گرفتن از Master Mix 2x از شرکت ®Primer Design در واکنش‌های ۱۵ میکرولیتری و با تکرارهای سه تایی انجام شد. چرخه های دمایی به صورت ۱۰دقیقه   ۹۵ و ۴۰ چرخه   ۹۵ به مدت ۱۵ ثانیه و   ۶۰ به مدت ۳۰ ثانیه بود. اندازه‌گیری میزان فلورسانت توسط دستگاه Applied Biosystems 7500و آنالیز اولیه داده‌ها توسط نرم‌افزار ۷۵۰۰ software system ver.2.0 انجام شد.
پروتکل استفاده از Master Mix شرکت Primer Design® در دستگاه Applied Biosystems 7500 در جدول۳-۲ و برنامه دمایی در جدول ۳-۳ ذکر شده است.
جدول۳-۲: دستورالعمل انجام واکنش بر اساس کیت سازنده

Volume Reagent
۷.۵μl Precision Mastermix(with low ROX)
× μl Forward Primer (6 pmol)
× μl Reverse Primer (6 pmol)
× μl TaqMan® probe (3 pmol)
× μl Template(25ng)
× μl RNase/DNase free water(up to final volume)
۱۵ μl Final volume

برنامه دمایی به دستگاه Real-Time بصورت زیر داده شد :
جدول۳-۳ :جدول برنامه زمانی Real-timePCR

مرحله دما درجه
Enzyme activation-Hotstart (1 Cycle)
موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...